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    细胞组织张力和细胞渗透压以促进小肠隐窝形成

    2021-12-08 18:23:00

    细胞组织张力和细胞渗透压以促进小肠隐窝形成
              类器官作为近十年来新兴的三维组织培养模型，其优势在于可以在体外一定程度上复制体内组织的细胞组成、形态结构乃至生理学功能。作为体外培养系统，类器官比起哺乳动物模型更易于在单细胞及分子层面上进行基于成像的大规模表型分析。该课题正是利用小肠类器官的优势，克服了小肠作为内脏难以进行大规模细胞实时活体成像的困难，结合物理学模型分析，对富集小肠成体干细胞的隐窝组织（crypt）的形态发育进行了突破性的研究。
     
            在类器官里小肠隐窝的发育始于潘氏细胞（Paneth Cell）的出现。潘氏细胞分泌Wnt 等干细胞诱导因子，促进干细胞的生成。干细胞和潘氏细胞聚集形成隐窝组织，隆起并逐渐发育为成熟的芽状结构。该结构对于隐窝维持小肠干细胞库至关重要，但此形态发生的发育过程和机制由于小肠活体研究的难操作性长期缺乏足够的研究。



            Liberali组首先通过对细胞连接蛋白的免疫荧光染色和成像，分割出小肠绒毛组织(villus) 和隐窝组织（crypt）内所有细胞的顶膜（apical membrane，上皮细胞对应腔体的细胞膜）及基底膜（basal membrane， 上皮细胞对应细胞外基质的细胞膜，通常位于顶膜的对立面）的形状。近万单细胞顶膜和基底膜的统计结果确定了绒毛组织基底膜和隐窝组织顶膜显著收缩的表型。通过激光片层扫描显微镜长时间追踪记录带有荧光蛋白标记的类器官发育过程和利用机器学习分割组织的三维结构，发现隐窝形成伴随类器官腔内空间的剧烈减小。



           细胞膜收缩和腔体体积减小均属于组织形态变化的一部分，而形态的变化受机械力的调控。为了充分理解这两种表型背后的力学原理，以及它们与隐窝芽状结构形成的相关性，Hannezo组设计了涵盖细胞顶-基极性、单细胞结构、绒毛-隐窝组织区域划分、组织厚度和类器官腔体大小的三维顶点模型（3D vertex model）。通过模型演算和实验测量对比，最终确定绒毛和隐窝组织在顶-基极性上相反的组织张力可以导致隐窝出芽。Liberali组通过在活细胞膜上的激光切割和显微吸量实验，检测出课题最初测量到的绒毛组织基底膜和隐窝组织顶膜显著收缩直接对应其更强的组织张力，至此为力学机制提供了重要的实验支持。绒毛组织基底膜和隐窝组织顶膜对应的强组织张力分布由该课题命名为组织自发性弯曲, 对应脂质双分子膜领域内的自发性弯曲（spontaneous curvature）经典力学模型。进一步模型演算推导出腔体体积减小可以极大促进隐窝出芽过程，而该机制也符合传统自发性弯曲力学模型的原理。一系列调节类器官组织张力和腔体体积的实验均验证了模型理论的正确性。并且模型预测到一种从未检测过的新表型也得到实验结果的吻合，即隐窝出芽后腔体即使被诱导极端膨胀，也不会消除已经形成的芽状结构。此表型解释了生理学上，当腹泻的症状发生时，小肠隐窝可以保持芽状结构，进而维护干细胞群和肠道上皮的稳态。



           接下来Liberali组通过单细胞测序、蛋白表达成像、药物处理等功能性研究结合类器官个体和单细胞水平的大规模图像分析统计确定了组织自发性卷曲和腔体体积缩小的分子细胞学机制。其中组织自发性卷曲主要由非肌细胞肌动球蛋白产生的细胞膜上的机械力导致。而干细胞和潘氏细胞都具有产生顶膜张力的能力，且干细胞产生的顶膜张力更强。分化的绒毛组织的肠上皮细胞（enterocyte）则产生独特的基地膜张力。有趣的是， 细胞分化诱导实验暗示腔体缩小也是由肠上皮细胞引起。模型推算同时得出类器官的总体积大致不变，腔体体积剧烈变小，如果腔体体积转移到绒毛组织，力学上对隐窝出芽的帮助远大于转移到其他组织里。类器官单细胞体积和小鼠肠道上皮单细胞大小测量均支持肠上皮细胞的体积增加对应腔体体积减小。最终通过筛选测试一系列和吸收功能有关的蛋白及蛋白功能实验验证了小肠上皮细胞细胞膜上的钠-葡萄糖协同转运蛋白通过调节细胞渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）吸收腔内液体进而缩小腔体体积。

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